酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种用于检测可溶性抗原或抗体的免疫反应定性和定量的技术。此方法通过将抗原或抗体结合到聚苯等固相载体上，利用抗原与抗体之间的专一性结合，能够有效地分析血清、尿液、细胞上清等液体中的特定抗原，以达到定量判断的目的。

ELISA的基本原理是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，从而在固相表面进行酶标记的抗原抗体反应。实验中需要设置标准孔、空白孔和待测样本孔。在标准孔中加入100μL倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL标准品与样本的稀释液，其他孔则加入100μL待测样本。为了确保结果的准确性，建议为所有待检样本和标准品设置复孔，并根据预实验或技术支持确定适当的稀释倍数。

在实验操作中，首先将样品加于酶标板底部，切忌触及孔壁，轻轻晃动以混匀，同时避免气泡产生。加样时间应控制在10分钟内。完成加样后需要甩干孔内液体，无需进行洗涤。

接下来，每个孔加入100μL生物素化抗体工作液，之后再次覆盖酶标膜并在37℃温育1小时。之后，重复甩净孔内液体，并在洁净的吸水纸上拍干。每孔加350μL洗涤液，浸泡1分钟后甩去液体，拍干。此步骤可使用洗板机完成，节省时间。洗板完成后，立即进行后续实验操作，避免微孔板干燥。

每孔加入100μL HRP酶结合物工作液，继续在37℃温育30分钟。再次甩净孔内液体，并重复洗板5次。在此之后，每孔加入90μL底物溶液（TMB），覆盖酶标膜并在37℃避光孵育约15分钟。可根据显色情况适当调整时间，但不宜超过30分钟。当标准孔中出现明显的蓝色梯度时，可以终止实验。

在终止反应时，每孔加入50μL终止液，建议尽量按照底物溶液加样的顺序进行。随后，使用酶标仪在450nm波长下测量各孔的光密度（OD值）。需要注意的是，实验操作条件不同，标准曲线的OD值可能会有所差异。以下为某实验室建立的标准曲线数据，供参考使用：NE浓度（ng/L）与OD值的关系为200、236、310、015、445、009、482、506、191、250、316、008、1。

关于血清、血浆或其他液体样本的检测，每个指标需要100μL样本；未经分离处理的全血样本（1mL）大约可获得100-200μL血清，具体情况需根据客户送样情况确定。全血样本应当在4℃下保存并送检，其余液体样本则需在-20℃下冷冻存储。对于组织样本，建议至少提供0.1克（相当于黄豆大小），经过匀浆后可分离出约500μL的上清液，用于检测5个指标，并需在-20℃保存送检。

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